Finalmente se concluye este 5to semestre con un aprendizaje muy satisfactorio, ya que todo lo que se dio en la capacitación laboratorista químico en seguidamente se llevo a la practica y esto permite ademas de conocer la teoría, tener experiencias de como se realiza.
lunes, 8 de diciembre de 2014
domingo, 23 de noviembre de 2014
CALDO DE UREA
Caldo de Urea.
Uso
Se emplea para la diferenciación de bacterias por medio de la utilización de la urea como única fuente de carbono.
Principio
La enzima ureasa hidroliza la urea en amoníaco y anhídrido carbónico, ante la variación de pH por la alcalinización, el indicador rojo de fenol, vira de amarillo claro a ligeramente rosado o rosa mexicano.
Se utiliza solamente para la detección de la actividad de la ureasa en especies del género Proteus que dan la prueba positiva después de una incubación de 8 h. Si los nutrientes suministrados por el extracto de levadura se consumen antes de que la bacteria muestre un crecimiento aceptable no podrá determinarse con exactitud su capacidad de hidrolizar la urea. Si un microorganismo es capaz de hidrolizar la urea, pero no de utilizar el amoníaco como fuente de nitrógeno, no se produce crecimiento y es posible observar un resultado falso negativo. No se recomienda para las bacterias con reacción de ureasa retardada. Sembrar el medio de cultivo con el cultivo puro de ensayo. Incubar 24 – 48 h a 35ºC. En ocasiones hasta 72 horas.
se utiliza
Se utiliza para la valoración de la producción de ureasa por algunas enterobacterias. Este medio contiene glucosa, peptona, urea y rojo de fenol. Las bacterias que producen ureasa a partir de la urea dan lugar al carbonato de amonio y el indicador se vuelve rojo púrpura. Obsérvese en la tabla de reacciones bioquímicas que solo el género Proteus da esta reacción positiva.
Características de identidad.
1. Utilización de urea como fuente de carbono.
2. La enzima ureasa hidroliza la urea en amoniaco y anhídrido carbónico, ante la variación del pH por la alcalinización el indicador Rojo Fenol, vira de amarillo claro a ligeramente rosado o rosa mexicano.
3. Se utiliza solamente para la detección de la ureasa en especies del género Proteus.
4. Si los nutrientes suministrados por el extracto de levadura se consumen antes que la bacteria muestre crecimiento no podrá determinarse con exactitud su capacidad de hidrolizar urea.
5. Pero si es capaz de hidrolizar la urea, pero no utilizar el amoniaco como fuente de nitrógeno, no se produce crecimiento y puede dar un falso negativo.
LA UREASA
La ureasa
Es una enzima que cataliza la hidrólisis de urea a dióxido de carbono y amoníaco. La reacción ocurre de la siguiente manera:
(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3
AGAR HIERRO KLIGER
8 de octubre del 2014
Kligler Hierro Agar.
Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiología de alimentos para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa y lactosa, y a la producción de ácido sulfhídrico.
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es el agente solidificante.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.
Fórmula (en gramos por litro)
| Instrucciones | |
Peptona de carne
|
13.0
|
Suspender 54.8 g del polvo por litro de
|
Cloruro de sodio
|
5.0
| |
Lactosa
|
10.0
| |
Tripteina
|
10.0
| |
Glucosa
|
1.0
| |
Citrato de hierro y amonio
|
0.5
| |
| Tiosulfato de sodio |
0.3
| |
| Rojo de fenol |
0.025
| |
Agar
|
15.0
| |
pH final: 7.3 ± 0.2
| ||
Siembra
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar el medio de cultivo, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.
Incubación
A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.
Resultados
1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.
2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, y lactosa.
3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares.
4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.
5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.
Microorganismo
|
Pico/Fondo
|
Producción de gas
|
Producción de
ácido sulfhídrico
|
E. coli ATCC 25922
|
A/A
|
+
|
-
|
K. pneumoniae ATCC700603
|
A/A
|
+
|
-
|
P. mirabilis ATCC 43071
|
K/A
|
+
|
+
|
S. typhimurium ATCC 14028
|
K/A
|
-
|
+
|
S. enteritidis ATCC 13076
|
K/A
|
+
|
+
|
S. flexneri ATCC 12022
|
K/A
|
-
|
-
|
P. aeruginosa ATCC 27853
|
K/K
|
-
|
-
|
A: ácido
K: alcalino
Características del medio
Medio preparado: rojo
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
AGAR STAFILICOCUS 110
6 de octubre del 2014
Estafilococo Medio 110.
Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciación presuntiva de estafilococos, en base a la producción
de pigmentos, la fermentación de manitol y la hidrólisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.
Fundamento
Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicación alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios sólidos selectivos: Baird Parker Medio (B02-141-05/06), Manitol Salado Agar (B02-118-05/06), o Estafilococo Medio 110 (B02-105-05/06).
En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, para inhibir el desarrollo de la flora acompañante excepto Staphylococcus spp., lográndose así un medio selectivo para el desarrollo de estos microorganismos.
Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente, es que permite, en la misma placa,
obtener pruebas de identificación presuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentación de manitol e hidrólisis de la gelatina.
Fórmula (en gramos por litro)
|
Instrucciones
| |
Extracto de levadura
|
2.5
|
Suspender 149 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Verter en placas y mezclar para dispersar el precipitado.
|
Tripteína
|
10.0
| |
Gelatina
|
30.0
| |
Lactosa
|
2.0
| |
D-Manitol
|
10.0
| |
Cloruro de sodio
|
75.0
| |
Fosfato dipotásico
|
5.0
| |
Agar
|
15.0
| |
pH final: 7.0 ± 0.2
| ||
Siembra
Directa, en superficie, por estriado o por extensión.
Incubación
Durante 48 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.
Resultados
Observar las características de las colonias y realizar las pruebas de identificación de microorganismos.
1-Fermentación de manitol: agregar unas gotas de púrpura de bromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas y en una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar el color desarrollado entre estas dos zonas.
Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de crecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismos permanece sin cambio.
Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento bacteriano y la zona sin inocular.
2-Hidrólisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solución saturada de sulfato de amonio y colocar en estufa, a 35-37 ºC, en aerobiosis durante 10 minutos.
Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.
Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.
Microorganismo
|
Pigmento
|
Fermentación de manitol
|
Hidrólisis de la gelatina
|
Prueba de la coagulasa
|
S. aureus ATCC 25923
|
+
|
+
|
+
|
+
|
S. aureus ATCC 6538
|
+
|
+
|
+
|
+
|
S. epidermidis ATCC 14990
|
-
|
-
|
+
|
-
|
Notas:
“Realización de la Prueba de la coagulasa”: agregar a 0,5 ml de plasma heparinizado (preferentemente de conejo o humano), igual volumen de un cultivo de 24 horas en Cerebro Corazón Infusión (B02-146-05/06), obtenido a partir de las colonias sospechosas. Incubar a 35-37 °C durante 2 a 3 horas, en aerobiosis. Los estafilococos coagulasa positivos forman un coágulo antes de ese período.
Limitaciones
-Algunas cepas de Enterococcus faecalis, fermentadoras de manitol, pueden desarrollar en este medio.
-Para realizar la prueba de la coagulasa, se aconseja subcultivar las colonias sospechosas en medios sólidos o líquidos no selectivos, por ejemplo: Agar Nutritivo, Infusión Cerebro Corazón, Triptosa Fosfato Caldo, debido a que si se realiza directamente de este medio de cultivo, puede afectarse la detección por el alto contenido de cloruro de sodio.
Características del medio
Medio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
CARACTERÍSTICAS DEL AGAR E.M.B
E.M.B. Agar.
Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.
Fundamento
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.
Fórmula (en gramos por litro)
|
Instrucciones
| |
Peptona
|
10.0
|
Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y distribuir agitando suavemente.
|
Lactosa
|
5.0
| |
Sacarosa
|
5.0
| |
Fosfato dipotásico
|
2.0
| |
Agar
|
13.5
| |
Eosina
|
0.4
| |
Azul de metileno
|
0.065
| |
pH final: 7.2 ± 0.2
| ||
Siembra
En superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para obtener colonias aisladas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
Incubación
De 24 a 48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.
Resultados
Microorganismos
|
Tipo de Colonia
|
Escherichia coli ATCC 25922
|
Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado
|
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
|
Mucosas, rosa púrpura, confluentes
|
Proteus mirabilis ATCC 43071
|
Incoloras
|
Enterococcus faecalis ATCC 29212
|
Incoloras, pequeñas, puntiformes
|
Shigella flexneri ATCC 12022
|
Incoloras
|
Salmonella typhimurium ATCC 14028
|
Incoloras
|
Características del medio:
Placas preparadas: color púrpura.
La esterilización del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color púrpura se restaura por agitación. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.
Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
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